鹿児島大学農学部 焼酎・発酵学教育研究センター

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醸造微生物学部門

研究紹介

 酵母や麹菌は、私たちの日常の食生活に密接に関わっている微生物です。例えば、パンがふっくら焼き上がるには酵母が必要ですし、ビール・ワイン・日本酒・焼酎などは、酵母の発酵能力によってできあがります。麹菌は、焼酎や日本酒を造るときサツマイモや米などに含まれるデンプンを分解してブドウ糖をつくります。酵母はこのブドウ糖から二酸化炭素とアルコールをつくるのです。そのほかにも酵母や麹菌は、酢、味噌、醤油などの醸造食品に広く用いられています。私たちは、これら酵母や麹菌が、醸造における様々な環境に適応するメカニズムの解明を行うことでより良い発酵食品を作ることのできる醸造微生物の育種をめざして研究を行っています。
 また、酵母は、ヒトと同じ真核生物であり、優れたモデル生物として非常に多くの研究に用いられています。生命現象の中で重要な機構は、ヒトから酵母にいたるまで広く保存されていることから、私たちは、酵母の研究を通して全ての生物に共通した生命現象のメカニズムを明らかにする研究にも取り組んでいます。

研究テーマ

①焼酎酵母分子育種のための基盤形成
②酵母の細胞膜リン脂質リモデリングの解明
③麹菌のクエン酸生成機構の解明
④麹菌の生産する糖分解酵素に関する研究
⑤酵母の栄養源認識とシグナル伝達経路の解明
⑥耐熱性酵母を用いた物質生産系の構築

①焼酎酵母分子育種のための基盤形成

 醸造微生物である酵母の育種に関しては、これまでに紫外線照射や変異剤処理によって主に清酒業界で行われてきました。しかしながら、醸造に用いられる酵母は、通常2倍体である場合が多く、そのことから変異株の取得は多大な時間と労力を要する作業となっています。我々人類も2倍体生物であり、すなわち父親と母親からそれぞれひとそろいの遺伝子を受け継いでいるのですが、このことはつまり2倍体生物には同じ遺伝子が2つ存在することを意味しているのです(対立遺伝子)。酵母の育種においては、特定の遺伝子を働かなくすることで、これまでにない代謝生成物の蓄積により新たな味や香りの製品を生み出すことができ、その組み合わせは無限に存在すると考えられています。これまでの酵母の育種法は、紫外線照射や変異剤処理により遺伝子に損傷を引き起こすことで行われてきました。しかしこの方法では、目的の遺伝子のみをターゲットとすることはできず、また目的以外の遺伝子にも損傷を与えてしまう恐れを含んでいるのです。さらに、醸造用酵母は2倍体であるために同じ遺伝子を2つ持つことから、それら2つの遺伝子を1度に働かなくすることは確率的に非常に低く、そのため変異株の取得には多大な時間と労力を要するものなのです。
 この研究では、ヘテロ接合性消失(LOH; Loss of Heterozygosity)という現象(図1)を利用した簡便な焼酎酵母の遺伝子破壊方法の構築を目的として研究を行っています。

図1 LOH (Loss of Heterozygosity)相同染色体間での組換えによりヘテロな遺伝子座位がホモとなる現象
図1 LOH (Loss of Heterozygosity)
相同染色体間での組換えによりヘテロな遺伝子座位がホモとなる現象

②酵母の細胞膜リン脂質リモデリングの解明

 細胞膜は半透性の脂質2重層からできていてこれによって細胞質と外環境を隔てています。細胞膜の主な構成成分であるリン脂質は、酸化などによって不飽和結合が切断された場合などに短くなったアシル鎖を切り離しリゾリン脂質とした後、新たなアシル鎖を導入するメンテナンス機構が存在し、これを脂質のリモデリングといいます(図2)。前者を触媒するのがホスホリパーゼなどのエステル分解酵素であり、後者を触媒するのがアシル転移酵素と考えられています。しかしながら、これらの酵素とリモデリングの関連はほとんど解明されておらず、特にリゾリン脂質を受容体基質とするアシル転移酵素に関しては全く同定されていませんでした。
私たちは、出芽酵母全遺伝子のうち致死でない約5,000の遺伝子を1つずつ破壊した遺伝子破壊株のセットについてスクリーニングを行い、1株だけ活性を持たない株を見出しLPT1と命名しました。LPT1は、membrane bound O-acyltransferase (MBOAT) スーパーファミリーのモチーフを持ち、酵母からヒトにいたるまでホモログが見出されましたがこれまでに研究されていない新規な酵素であることが分かりました。私たちは、Lpt1-GFPが小胞体膜上に局在すること(図3)、Lpt1がさまざまなリン脂質に基質特異性を示すこと、リゾフォスファチジン酸 (LPA)の生合成をもう一つのアシル転移酵素Slc1と協調して行うことを明らかにするとともにさらなる研究を続けています。

酵母の細胞膜リン脂質リモデリングの解明
図2 リン脂質のリモデリング
図3 LPT1-GFPの細胞内局在性
図3 LPT1-GFPの細胞内局在性

③麹菌のクエン酸生成機構の解明

 焼酎醸造においては焼酎麹菌が生産するクエン酸によりもろみが酸性となることにより雑菌の生育を抑えます。麹製造の前半は発酵熱により比較的高温で推移しますが、クエン酸は高温ではあまり生産されないため、麹製造の後期では温度を35℃程度に低下させる必要があります。私たちは、温度を下げるとなぜクエン酸が生産されるのかについて検討するとともに麹菌におけるクエン酸生産のメカニズムについても研究しています。

④麹菌の生産する糖分解酵素に関する研究

 麹製造の目的の一つは酵素の生産です。麹菌はさまざまな糖質分解酵素を生産しますが、これらの酵素の生産はその条件や菌株(焼酎麹菌や清酒麹菌等)によっても異っています。そこでこれらの糖分解酵素の生産メカニズムについて分子あるいは遺伝子レベルで明らかにする研究を展開しています。

⑤酵母の栄養源認識とシグナル伝達機構の解明

 酵母は自らを取り巻く環境中の栄養状況をモニターして増殖や分化への切換えを行っています。たとえば代表的な栄養源であるグルコースは、細胞内のcAMPレベルを上昇させることで増殖のスイッチをONにすると考えられています。ところが、グルコースを感知する受容体に関しては、これまで全くわかっていませんでした。私たちは、グルコースシグナル伝達経路に関与すると考えられていた3量体Gタンパク質に着目し、その分子と共役する遺伝子GPR1をクローニングすることに成功しました。GPR1は7回膜貫通型の典型的なGタンパク質共役型受容体(図4,左上)をコードしており、クラゲの緑色蛍光タンパク質(GFP)と融合させて共焦点レーザー顕微鏡で観察すると、細胞表層の細胞膜に局在することがわかりました(図4,左下)。GPR1遺伝子を破壊した株では、グルコース添加による細胞内cAMPレベルの一過的な上昇が見られなくなったことから(図4,右上)Gpr1タンパク質は、グルコース受容体であることが明らかとなりました。出芽酵母は栄養状況に応じて形態を変化させます。たとえば2倍体細胞を高グルコース・低窒素源条件下におくと、偽菌糸形成 (Pseudohyphal growth) とよばれる一見カビの様な菌糸状の増殖形態をとります(図4,右下)。私たちは、GPR1遺伝子破壊株およびGタンパク質であるGPA2遺伝子破壊株では、偽菌糸形成が起こりにくくなり、また培地中へのcAMPの添加が偽菌糸形成不全を回復させる(抑圧する)ことからcAMP経路は細胞の増殖のみならず分化をも制御していることを明らかにしました。

酵母の栄養源認識とシグナル伝達機構の解明
図4

⑥耐熱性酵母を用いた物質生産系の構築

 石油資源の枯渇を視野に入れた新しい代替エネルギーとしてのエタノールの生産はたいへん注目されており、その中でセルロースはエタノール生産の原料としてたいへん魅力的です。私たちは耐熱性セルラーゼを高生産する耐熱性酵母を構築し、セルロースからエタノールを発酵生産するプロジェクトに取り組んでいます。
セルロースは、グルコースがβ1-4結合した多糖類ですが、その分解には複数の糖分解酵素が作用する必要があります。その代表的な酵素は、endo-b-1,4-glucanase、cellobiohydrolase、b-glucosidaseであり、これらを総称してセルラーゼと呼びます。私たちはこれら3つの酵素に関して耐熱性を示すものを耐熱性のカビなどに検索し、それぞれの酵素の遺伝子をクローニングしました。一方で私たちは、エタノール生産能の高い耐熱性酵母を検索しKluyveromyces marxianusを選定し、この酵母での遺伝子発現系を構築しました。そして3つの耐熱性セルラーゼ遺伝子を高発現プロモーターの下流につなぎ、染色体挿入型ベクターを用いてK. marxianusを形質転換し、耐熱性セルラーゼ生産株の構築に成功しましたました(図5)。得られた株は、Carboxylmethylcellulose(CMC)を単一炭素源として生育でき、エタノール発酵を行うことができました。

耐熱性酵母を用いた物質生産系の構築
図5
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